神经干细胞的培养方法及其优缺点

   时间:2019-03-13 17    浏览:6900   标签: 无标签

  1、从神经组织分离培养

  分离培养NSC的经典方法是从新生动物或胚胎的神经组织中有NSC分布的某一区域分离细胞,如室管膜下区/海马或胚胎脑的大多数结构。采用机械法或酶消化法分散组织获取细胞,以含高浓度有丝分裂原如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF-2)和/或表皮生长因子(EGF)的无血清培养基进行培养。NSC培养方法按生长方式分为悬浮培养法(又可分为传统神经球法、集落形成法)和贴壁培养法。

  2、传统神经球法

  1992年,Reynolds等[2]率先采用神经球法建立了NSC的培养方法。具体方法:①组织取材后经酶解消化,经机械吹散后,调整活细胞浓度为5000~10000/ml,置于未包被的培养皿中培养,在基础培养基DMEM/F 12 (1: 1)中加入人重组EGF和bFGF各20 ng/ml。培养皿中大部分细胞于2d后死亡,但有少量可继续分裂、增殖,形成细胞球,即神经球,几乎都是Nestin(+)。

  优点:由于方法简单,只要严格按照程序操作重现性就很好。神经球法是分离、扩 增和研究胚胎和成体NSC最常用的方法。

  缺点:①神经球形成过程中除发生细胞增殖外,还存在融合现象。②神经球并非全部只来自NSC,NSC和神经前体细胞的增殖均能形成神经球。③神经球是一个异质性结构。

  3、集落形成法

  为了区分NSC和神经前体细胞增殖形成的克隆,Louis等建立了神经集落形成细胞实验。具体方法:该法采用无血清培养基,以克隆密度将神经细胞接种至半固态胶原基质以确保克隆性,培养3-4周至细胞形成大小不同的克隆,因为NSC与神经前体细胞相比表现出更强的增殖能力,只有直径大的克隆(如大于2mm)才具有干细胞特征。

  优点:在很大程度上区分了NSC与神经前体细胞形成的克隆,更适合用于评价NSC的增殖能力和定量分析。

  缺点:与神经球法一样仍属于悬浮培养,不利于进行细胞形态学的观察。

  4、贴壁培养法

  近来研究发现NSC不仅能在贴壁剂包被过的表面贴壁生长,也能在按照特定程序培养传代后在未处理过的表面贴壁生长,得到同质性更高的干细胞群[9]。RAY[10]等将胚胎海马来源的细胞接种于多聚鸟氨酸和粘连蛋白包被的细胞培养板,以含DMEM /F-12, N2和bFGF的培养基培养,得到能连续传代(>5个月)的nestin阳性细胞。WAKEMAN等建立了人胚来源NSC的多层贴壁网络,NSC可直接贴附在培养表面而不需要贴片剂的包被。获得细胞能克降生长、对称分裂、同质化程度高,可作为纯化的NSC来源。

  优点:与悬浮培养法相比,贴壁培养法更利于进行细胞形态学的观察,获取大量同质化的细胞。

  缺点:当使用某些贴片剂时可能会诱导NSC的分化,也可能会干扰某些研究结果。

  5、从ESC等其它组织来源的干细胞诱导获得

  NSC还可由ESC、间充质干细胞、诱导性多能干细胞等来源的干细胞在一定条件下诱导分化获得。ZHANG等[11]的研究发现,以拟胚体形式生长的ESC在添加bFGF的培养基中能够分化为Nestin和Musashi-1表达阳性的NSC,以及分化的神经元和胶质细胞,利用酶处理后细胞贴壁性的差异能够得到纯化的具有分化能力的NSC。

  优点:来源广泛,自体移植不存在免疫排斥。能在体内与受体神经组织很好地整合,真正实现神经再生与功能修复。

  缺点:存在伦理学争议,尤其是胚胎干细胞的获取会损伤胚胎。

  6、从永生化的NSC获得

  永生化NSC是指在体外利用逆转录病毒使癌基因等转染NSC,使之能够保持持续增殖状态。如c-myc和SV-40大T抗原是NSC永生化转染时最常用的两种癌基因。由于永生化过程中转入基因的不同,培养基成分也有很大差异。一些仍需要无血清培养基和bFGF和EGF等生长因子的维持,一些在含有血清的培养基中也能够自我更新。

  优点:无限传代,细胞产量大,原材料的获取成本较低。

  缺点:①可能发生遗传学差异,具有潜在的致瘤性。②生物学特性存在差异。利用生物学实验、基因芯片、逆转录聚合酶链式反应、免疫细胞化学等技术发现,C17. 2与其来源于的NSC和小脑颗粒层前体细胞显著不同。


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